.jpg)
近年来，热疗逐渐成为肿瘤治疗的常用手段，由于高热对机体有损伤，限制了温度的提高，使疗效难以进一步提高，因此热增敏的研究正广泛展开。蝎毒是抗癌有效中药全蝎尾节毒囊的分泌物，具有良好的抗癌效应，合理使用安全性较大［1］。我们研究了蝎毒对热疗的增敏效应并探讨了其作用机制，从1983年至今国内外鲜见有关报道。
1 材料与方法
1.1 动物 NIH小鼠，由美国引进，河南省肿瘤研究所繁殖。雌雄各半。6～8周龄，体重18～22g，每组10只。普通饲料喂养，室温18～22℃，湿度60%±5%，饲料及垫料均经消毒处理。实验前小鼠适应环境3天。
1.2 移植性实验肿瘤 Lewis肺癌细胞株购自中国医科院药物所，C57BL小鼠传代保种。
1.3 药物 蝎毒由洛阳解放军济南军区肛肠中心提供。用无菌生理盐水配制浓度为0.06g/L溶液，4℃冰箱保存；程序性细胞死亡检测试剂盒由美国进口，华美生物工程公司分装、提供。
1.4 加温 肿瘤的局部加温在精密恒温水浴箱中进行。水温用贝克曼温度计(精确度0.01℃)校正，水浴温度控制在±0.01℃以内。荷瘤动物用戊巴比妥钠腹腔麻醉，60mg/kg，将其荷瘤腿浸入水浴中并使瘤体低于水面至少5mm，加温43℃ 25分钟。
1.5 方法 无菌条件下将生长良好的Lewis肺癌病灶从荷瘤小鼠腋下取出，选取正常瘤块，剪碎后用生理盐水按1∶3匀浆、稀释，去掉残渣，以5×105肿瘤细胞接种于NIH小鼠右后肢外侧皮内。随机分为蝎毒组、热疗组、蝎毒→热疗组、盐水对照组，接种后6天左右用游标卡尺测量肿瘤的三个互相垂直的直径，取其平均值(MD)，当MD达到6mm左右时开始实验，蝎毒组一次性腹腔注射蝎毒0.6mg/kg，热疗组按前述要求进行，盐水对照组同样进行腹腔麻醉、等容生理盐水腹腔注射、37℃ 25分钟加温，实验中蝎毒与热疗的联合应用，时间间隔不超过10分钟，上述治疗仅进行一次。
1.6 观察指标
(1)实验开始后，每隔一天测量一次肿瘤MD。当动物肿瘤MD达到治疗开始时的2倍以上时，停止测量，计算肿瘤倍增时间(MDDT)。被治疗动物一直饲养到自然死亡，计算其存活时间(AST)，即自接种到死亡的天数。
(2)实验开始后第3天脱颈处死小鼠，完整剥离瘤体，10%福尔马林固定，常规石蜡包埋，取病理切片。一组HE染色，光镜观察肿瘤组织的坏死及细胞形态改变；另一组进行免疫组化实验，观察细胞程序性死亡即凋亡情况。
(3)疗效判断方法：计算各观察组与对照组的MD之差即为d值。若d(联合组)大于或等于d(各个单纯治疗组)之和，为协同相加作用，即增敏作用；若d(联合组)小于d(各个单纯治疗组)之和，为拮抗作用。
2 结果
2.1 对荷瘤小鼠瘤体和小鼠生存期的影响 d(蝎毒→热疗)等于d(蝎毒)+d(热疗)，说明蝎毒对热疗有协同相加作用。所有治疗组均可延长荷瘤小鼠生存期，联合治疗组效果好于单纯治疗组(表1)。
表1 蝎毒对热疗的增敏意义
| 组别 | 例数 | MDDT(天) | AST(天) | P※ | ||
 ±s
|
P※ | d | ||||
| 对照 | 10 | 10.2±0.34 | 31.0±2.4 | |||
| 蝎毒 | 10 | 11.5±0.38 | ＜0.05 | 1.3 | 45.5±3.2 | ＜0.01 |
| 热疗 | 10 | 12.7±0.41 | ＜0.05 | 2.5 | 43.8±3.1 | ＜0.01 |
| 蝎→热 | 10 | 14.1±0.42 | ＜0.01 | 3.9 | 47.3±3.4 | ＜0.01 |
※ 均与对照组比较
2.2 治疗后瘤组织的病理改变 通过双盲法观察低倍镜下各组坏死区所占瘤组织的面积比例，可以看出蝎毒?热疗组比单纯治疗组具有更强的抗肿瘤作用(表2)。
表2 蝎毒对瘤组织病理、细胞凋亡的影响
| 组别 | 例数 | 坏死区 |
细胞凋亡 (‰) |
计算细胞 总数 |
| 对照 | 3 | 小局灶 | 2.04 | 3640 |
| 蝎毒 | 3 | 1/6～1/7 | 8.07 | 3640 |
| 热疗 | 3 | 1/4～1/3 | 7.15 | 4065 |
| 蝎→热 | 3 | 1/3～1/2 | 10.71 | 3640 |
高倍镜观察非坏死区细胞形态，发现在治疗组癌组织中有明显凋亡细胞，表现为：①有凋亡小体(即胞浆内出现的染色质颗粒)；②核固缩核膜厚薄不均，出现皱壁；③染色质积聚成大颗粒，贴近核膜；④细胞肿胀、胞浆红染。对高倍视野内凋亡细胞数进行统计，结果发现与组化方法细胞程序死亡实验得出的结果相同。
2.3 治疗后瘤组织的细胞凋亡 以生物素标定-dmTP免疫组化法标记，细胞核内出现棕色颗粒为阳性，即为凋亡细胞，以双盲法计算出每组各片、各视野的平均数，具体定量方法如下：①选择肿瘤内非坏死区及非边缘瘤组织；②用高倍镜计算每片单个视野中细胞总数；③每张切片中随机选择10个高倍视野，计算凋亡细胞总数，求出每片10个视野的凋亡比例(凋亡的细胞数/总细胞数×1000)，每组计数3片，然后计算出每组的平均数。结果表明蝎毒?热疗组的细胞凋亡明显高于各单独治疗组(见表2)。
3 讨论
作者单位：贺会江、黄静、黄传继、高春芳：洛阳市(471031) 洛阳解放军150医院肿瘤科
祁超：郑州市(450002) 河南医科大学附院肿瘤科
吴细丕：郑州市(450003) 河南省肿瘤研究所
参 考 文 献
1 孔天翰，董伟华，田中岭.全蝎及蝎毒抗肿瘤研究进展.河南肿瘤学杂志，1994，7(3)：244.
2 董伟华，孔天翰，郑智敏，等.河南马氏钳蝎粗毒对体外培养的人食管癌细胞株(Eca 109)的毒性.中国病理生理杂志，1992，8(1)：25.
3 吴保平，高春芳，张亚历，等.东亚钳蝎毒生物提取物对大肠癌细胞的体外抑杀实验.中国肛肠病杂志，1993，(4)：3.
4 董伟华，臧梦维，孔天翰，等.蝎毒组分Ⅱ对人喉癌细胞毒性的研究.中国医药学报，1994，9(4)：201.
5 吴细丕，曾金英.NIH小鼠和加温.中国实验动物学报，1993，1(2)：113.
想要了解更多蝎毒信息，请登录专业蝎毒供应——立诚蝎业www.xiedu168.com
