近年来,热疗逐渐成为肿瘤治疗的常用手段,由于高热对机体有损伤,限制了温度的提高,使疗效难以进一步提高,因此热增敏的研究正广泛展开。蝎毒是抗癌有效中药全蝎尾节毒囊的分泌物,具有良好的抗癌效应,合理使用安全性较大[1]。我们研究了蝎毒对热疗的增敏效应并探讨了其作用机制,从1983年至今国内外鲜见有关报道。
1 材料与方法
1.1 动物 NIH小鼠,由美国引进,河南省肿瘤研究所繁殖。雌雄各半。6~8周龄,体重18~22g,每组10只。普通饲料喂养,室温18~22℃,湿度60%±5%,饲料及垫料均经消毒处理。实验前小鼠适应环境3天。
1.2 移植性实验肿瘤 Lewis肺癌细胞株购自中国医科院药物所,C57BL小鼠传代保种。
1.3 药物 蝎毒由洛阳解放军济南军区肛肠中心提供。用无菌生理盐水配制浓度为0.06g/L溶液,4℃冰箱保存;程序性细胞死亡检测试剂盒由美国进口,华美生物工程公司分装、提供。
1.4 加温 肿瘤的局部加温在精密恒温水浴箱中进行。水温用贝克曼温度计(精确度0.01℃)校正,水浴温度控制在±0.01℃以内。荷瘤动物用戊巴比妥钠腹腔麻醉,60mg/kg,将其荷瘤腿浸入水浴中并使瘤体低于水面至少5mm,加温43℃ 25分钟。
1.5 方法 无菌条件下将生长良好的Lewis肺癌病灶从荷瘤小鼠腋下取出,选取正常瘤块,剪碎后用生理盐水按1∶3匀浆、稀释,去掉残渣,以5×105肿瘤细胞接种于NIH小鼠右后肢外侧皮内。随机分为蝎毒组、热疗组、蝎毒→热疗组、盐水对照组,接种后6天左右用游标卡尺测量肿瘤的三个互相垂直的直径,取其平均值(MD),当MD达到6mm左右时开始实验,蝎毒组一次性腹腔注射蝎毒0.6mg/kg,热疗组按前述要求进行,盐水对照组同样进行腹腔麻醉、等容生理盐水腹腔注射、37℃ 25分钟加温,实验中蝎毒与热疗的联合应用,时间间隔不超过10分钟,上述治疗仅进行一次。
1.6 观察指标
(1)实验开始后,每隔一天测量一次肿瘤MD。当动物肿瘤MD达到治疗开始时的2倍以上时,停止测量,计算肿瘤倍增时间(MDDT)。被治疗动物一直饲养到自然死亡,计算其存活时间(AST),即自接种到死亡的天数。
(2)实验开始后第3天脱颈处死小鼠,完整剥离瘤体,10%福尔马林固定,常规石蜡包埋,取病理切片。一组HE染色,光镜观察肿瘤组织的坏死及细胞形态改变;另一组进行免疫组化实验,观察细胞程序性死亡即凋亡情况。
(3)疗效判断方法:计算各观察组与对照组的MD之差即为d值。若d(联合组)大于或等于d(各个单纯治疗组)之和,为协同相加作用,即增敏作用;若d(联合组)小于d(各个单纯治疗组)之和,为拮抗作用。
2 结果
2.1 对荷瘤小鼠瘤体和小鼠生存期的影响 d(蝎毒→热疗)等于d(蝎毒)+d(热疗),说明蝎毒对热疗有协同相加作用。所有治疗组均可延长荷瘤小鼠生存期,联合治疗组效果好于单纯治疗组(表1)。
表1 蝎毒对热疗的增敏意义
组别 | 例数 | MDDT(天) | AST(天) | P※ | ||
±s | P※ | d | ||||
对照 | 10 | 10.2±0.34 | 31.0±2.4 | |||
蝎毒 | 10 | 11.5±0.38 | <0.05 | 1.3 | 45.5±3.2 | <0.01 |
热疗 | 10 | 12.7±0.41 | <0.05 | 2.5 | 43.8±3.1 | <0.01 |
蝎→热 | 10 | 14.1±0.42 | <0.01 | 3.9 | 47.3±3.4 | <0.01 |
※ 均与对照组比较
2.2 治疗后瘤组织的病理改变 通过双盲法观察低倍镜下各组坏死区所占瘤组织的面积比例,可以看出蝎毒?热疗组比单纯治疗组具有更强的抗肿瘤作用(表2)。
表2 蝎毒对瘤组织病理、细胞凋亡的影响
组别 | 例数 | 坏死区 |
细胞凋亡 (‰) |
计算细胞 总数 |
对照 | 3 | 小局灶 | 2.04 | 3640 |
蝎毒 | 3 | 1/6~1/7 | 8.07 | 3640 |
热疗 | 3 | 1/4~1/3 | 7.15 | 4065 |
蝎→热 | 3 | 1/3~1/2 | 10.71 | 3640 |
高倍镜观察非坏死区细胞形态,发现在治疗组癌组织中有明显凋亡细胞,表现为:①有凋亡小体(即胞浆内出现的染色质颗粒);②核固缩核膜厚薄不均,出现皱壁;③染色质积聚成大颗粒,贴近核膜;④细胞肿胀、胞浆红染。对高倍视野内凋亡细胞数进行统计,结果发现与组化方法细胞程序死亡实验得出的结果相同。
2.3 治疗后瘤组织的细胞凋亡 以生物素标定-dmTP免疫组化法标记,细胞核内出现棕色颗粒为阳性,即为凋亡细胞,以双盲法计算出每组各片、各视野的平均数,具体定量方法如下:①选择肿瘤内非坏死区及非边缘瘤组织;②用高倍镜计算每片单个视野中细胞总数;③每张切片中随机选择10个高倍视野,计算凋亡细胞总数,求出每片10个视野的凋亡比例(凋亡的细胞数/总细胞数×1000),每组计数3片,然后计算出每组的平均数。结果表明蝎毒?热疗组的细胞凋亡明显高于各单独治疗组(见表2)。
3 讨论
作者单位:贺会江、黄静、黄传继、高春芳:洛阳市(471031) 洛阳解放军150医院肿瘤科
祁超:郑州市(450002) 河南医科大学附院肿瘤科
吴细丕:郑州市(450003) 河南省肿瘤研究所
参 考 文 献
1 孔天翰,董伟华,田中岭.全蝎及蝎毒抗肿瘤研究进展.河南肿瘤学杂志,1994,7(3):244.
2 董伟华,孔天翰,郑智敏,等.河南马氏钳蝎粗毒对体外培养的人食管癌细胞株(Eca 109)的毒性.中国病理生理杂志,1992,8(1):25.
3 吴保平,高春芳,张亚历,等.东亚钳蝎毒生物提取物对大肠癌细胞的体外抑杀实验.中国肛肠病杂志,1993,(4):3.
4 董伟华,臧梦维,孔天翰,等.蝎毒组分Ⅱ对人喉癌细胞毒性的研究.中国医药学报,1994,9(4):201.
5 吴细丕,曾金英.NIH小鼠和加温.中国实验动物学报,1993,1(2):113.
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